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              細胞免疫熒光實驗步驟
              瀏覽次數:262發布日期:2020-11-30

              細胞株免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細胞內信號轉導,細胞免疫熒光技術是利用免疫技術和熒光標記技術相結合,原理就是利用抗原-抗體反應之后,采用熒光標記,標記完成后,顯微鏡下觀察細胞內某種抗原成分的多少,從而做出一個定位研究,也可以為細胞內信號傳導提供一個明確的指導,細胞免疫熒光具有敏感性強、特異性高、速度快的特點,是目前比較常用的組織學技術,也是比較準確的。

              一、實驗方法原理

              在進行細胞免疫熒光過程中,需要用到細胞爬片,通過將爬片浸在細胞培養基內,細胞在爬片上生長,進而進行細胞的免疫熒光。

              二、實驗材料

              1.細胞樣品

              2.試劑、試劑盒:多聚甲醛 70%甲醇 丙酮 PBS Triton  BSA DAPI染液 DABCO Tris 甘油

              3.儀器、耗材:玻片

              三、細胞爬片免疫熒光實驗步驟

              第yi天:

              1. 在培養板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次,每次3min;

              2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min, PBS浸洗玻片3次,每次3min;

              3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室溫通透20min(細胞膜上表達的抗原省略此步驟);

              4. PBS浸洗玻片3次,每次3 min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加正常山羊血清,室溫封閉30min;

              5. 吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過夜;

              第二天:

              6. 加熒光二抗: PBST 浸洗爬片3次,每次3min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中20-37℃孵育1h,PBST浸洗切片3次,每次3min;注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行。

              7. 復染核:滴加DAPI避光孵育5min,對標本進行染核,PBST 5minx4次洗去多余的DAPI;8. 用吸水紙吸干爬片上的液體,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

              注意事項

              1.取細胞株爬片時,動作應輕柔,防止將細胞爬片夾碎,影響實驗進程。

              2.種細胞過程中,要注意將細胞輕柔混勻,“八”字或者“十”字形搖晃,防止細胞局部生長過密。

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